• 四川大学华西医院卫生部移植工程与移植免疫重点实验室(成都 610041);
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目的 探索研究 p53 与线粒体共定位的最佳免疫荧光条件,为检测蛋白质与线粒体共定位的研究提供参考。方法 低氧处理 HeLa 细胞,免疫印迹检测 p53 表达;分别使用甲醇固定 HeLa 细胞、甲醇:丙酮混合液(体积比 1∶1)固定 HeLa 细胞、4% 多聚甲醛固定 HeLa 细胞,前二者不作通透处理,后者用 0.1% 聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X 100)通透,同时染色 p53 和线粒体;用 4% 多聚甲醛固定 HeLa 细胞后,降低 Triton-X 100 浓度至 0.05%、0.025%、0.01% 和 0.005%,同时染色 p53 和线粒体;用 4% 多聚甲醛固定 HeLa 细胞后,Triton-X 100 浓度降至 0.01% 和 0.005%,通透标记 p53 后再次使用 0.1% Triton-X 100 重新通透细胞器膜染色线粒体。结果 低氧后 p53 表达上调(P<0.01),可用于后续免疫荧光实验。使用甲醇和混合液固定组均可同时在细胞核及细胞质内观察到明显的 p53 信号,并可观测到其与线粒体的共定位,混合液组共定位更明显。多聚甲醛固定组用 0.1% Triton-X 100 通透后 p53 信号主要在细胞核内,未能观察到共定位;使用 4% 多聚甲醛固定后,降低 Triton-X 100 浓度至 0.05% 和 0.025% 在一定程度上削弱 p53 核内信号,增强共定位信号,但细胞核内信号仍强于细胞质,当降低至 0.01% 和 0.005%,细胞质内检测到 p53 信号,细胞核内未检测到 p53 信号,提示此条件下核膜未被通透,但同样也未能通透线粒体膜,导致线粒体标记失败;二次通透完全规避 p53 核内信号,并成功标记线粒体,检测到 p53 与线粒体的共定位。结论 使用甲醇或混合液固定可观察到 p53 与线粒体共定位,其中混合液效果更佳;使用 4% 多聚甲醛固定结合 2 次通透可有效避免核内信号,检测到 p53 和线粒体的共定位。

引用本文: 龙丹, 冯莉, 陈雪璐, 李胜富, 周彦妮. 免疫荧光检测 p53 与线粒体共定位的实验方法探索. 华西医学, 2020, 35(8): 948-953. doi: 10.7507/1002-0179.201908146 复制

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